PCR (Polymerase Chain Reaction) là gì?

 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi polymerase) là một trong những phát minh quan trọng nhất trong lĩnh vực sinh học phân tử, giúp khuếch đại ADN một cách nhanh chóng và chính xác. Kể từ khi được phát minh bởi Kary Mullis vào năm 1983, PCR đã trở thành công cụ không thể thiếu trong nghiên cứu khoa học, y học, pháp y, nông nghiệp và công nghệ sinh học.

PCR (Polymerase Chain Reaction) là gì?

PCR là một kỹ thuật nhanh chóng và hiệu quả được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu có kích thước nhỏ tạo ra hàng triệu bản sao của DNA.

Nói cách khác, PCR cho phép tạo ra hàng triệu bản sao của một chuỗi DNA cụ thể từ một mẫu nhỏ ban đầu hay thậm chí là một bản sao duy nhất.

Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện dựa trên nguyên tắc khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình luân nhiệt (có thể 20-40 chu kỳ) gồm 3 bước:

+ Biến tính (Denaturation 950C): tách rời DNA mạch đôi thành mạch đơn bằng nhiệt.

+ Bắt cặp (Annealing 400C – 700C) cho phép sự bắt cặp giữa mồi với khuôn mẫu DNA.

+ Kéo dài (Elongation 720C) mạch mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung nhờ DNA polymerase

Thành phần cần thiết của PCR

Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR bao gồm:

• Mẫu ADN: chứa trình tự mục tiêu cần khuếch đại
• Mồi (primer): các đoạn ADN ngắn được tổng hợp nhân tạo, chúng có nhiệm vụ bám vào hai đầu trình tự mục tiêu nhằm đánh dấu vị trí cần nhân bản. Các mồi này thường được tổng hợp bằng phương pháp hóa học
• Enzyme ADN polymerase: enzyme có chức năng tổng hợp mạch ADN mới
  dNTPs (A, T, G, C): nguyên liệu cấu tạo nên ADN
• Dung dịch đệm: tạo môi trường tối ưu cho enzyme hoạt động hiệu quả
• Muối magie clorua: kích hoạt enzyme ADN polymerase

Quy trình thực hiện kỹ thuật PCR

Người ta cho đầy đủ các thành phần phản ứng vào một ống li tâm nhỏ rồi đưa vào máy luân nhiệt, sau đó họ thiết lập các điều kiện của quy trình nhiệt. Một quy trình nhân đôi bao gồm các bước biến tính, ủ và kéo dài mạch ADN.

Bước 1: Biến tính

Hỗn hợp phản ứng được gia nhiệt lên 94–95°C trong 15–30 giây. Nhiệt độ cao phá vỡ liên kết giữa các base trong 2 mạch ADN khuôn, dẫn đến phân tử ADN tách ra thành 2 mạch đơn. Các ADN đơn là khuôn mẫu tạo ra bản sao mới. Bước này cần được duy trì nhiệt độ đủ lâu nhằm đảm bảo các sợi ADN tách hoàn toàn.

Bước 2: Ủ

Máy hạ nhiệt độ xuống 50–65°C nhằm tạo điều kiện cho các mồi gắn vào vị trí cụ thể trên ADN đơn. Các mồi bám vào ADN tạo nên vùng ADN kép ngắn làm điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp ADN.

Bước 3: Kéo dài

Máy luân nhiệt tăng nhiệt độ lên 72°C tạo điều kiện cho enzyme Taq polymerase tổng hợp ADN. Taq polymerase sẽ sắp xếp các base nitơ A, T, G và C thành mạch ADN mới dựa theo trình tự mạch khuôn. Thời gian thực hiện bước này tùy thuộc độ dài chuỗi ADN cần khuếch đại, thường 1 phút cho 1.000 cặp base.

Chu trình nhiệt thường lặp lại 20–40 lần (tùy theo quá trình cài đặt máy luân nhiệt) nhằm tạo ra nhiều bản sao trình tự ADN. Các đoạn ADN mới tạo ra trong chu trình trước sẽ làm khuôn mẫu cho enzyme gắn vào và tổng hợp ADN trong chu trình tiếp theo. Do đó, số lượng lớn bản sao của đoạn ADN mục tiêu được tạo ra trong khoảng thời gian tương đối ngắn.

Các kỹ thuật PCR thường gặp trong xét nghiệm

PCR đơn mồi (Simplex PCR)

Đây là kiểu PCR cổ điển nhất, sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại 1 đoạn trình tự mục tiêu duy nhất.

PCR đa mồi (Multiplex PCR)

Đây là kiểu PCR sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau để khuếch đại các trình tự mục tiêu khác nhau trong cùng 1 mix phản ứng.

• Để thiết kế được phản ứng Multiplex PCR đòi hỏi các cặp mồi sử dụng phải có cùng nhiệt độ bắt cặp và các cặp mồi này cũng không được bắt cặp với nhau hay bắt cặp chéo lẫn nhau.
• Đảm bảo độ nhạy Multiplex PCR tương đương với Simplex PCR, điều này rất khó xảy ra nên thông thường multiplex PCR được sử dụng ở các tế bào nuôi cấy vì lúc này số lượng trình tự đích đủ lớn sẽ không đòi hỏi quá khắt khe về độ nhạy.

PCR tổ (Nested PCR)

Sử dụng 2 cặp mồi, cặp mồi bên ngoài (outer primer) và cặp mồi bên trong (nested primer). Cặp mồi bên ngoài sẽ tham gia PCR lần 1 trước để làm tăng số lượng DNA chứa trình tự đích, kế đến là cặp mồi bên trong sẽ tham gia PCR lần 2 để phát hiện trình tự đích .

Kỹ thuật này sử dụng khi cặp mồi đặc hiệu cho trình tự đích (nested primer) có độ nhạy kém.

RT-PCR

Đây là quy trình sử dụng khi trình tự đích là RNA, lúc này cần một bước sử dụng enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA trước khi PCR, giai đoạn này gọi là giai đoạn RT.

Kỹ thuật RT-PCR có 2 loại:

• RT-PCR 2 bước: Bước ủ RT thực hiện ở 1 ống nghiệm riêng, cDNA tạo thành sẽ được chuyển vào ống nghiệm chứa PCR mix để thực hiện PCR.
• RT-PCR 1 bước: Cả 2 bước RT và PCR đều thực hiện trong 1 ống nghiệm duy nhất, mix ban đầu sẽ chứa cả các thành phần cho RT lẫn cho PCR.

Vai trò của PCR

Ứng dụng của kĩ thuật PCR

Phát hiện vi sinh vật gây bệnh

Kĩ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

• Trong đại dịch COVID-19, PCR được xem là phương pháp chẩn đoán phổ biến và đáng tin cậy. Bên cạnh đó, kĩ thuật này còn thường được sử dụng trong phát hiện AIDS, viêm gan C hoặc chlamydia.
• Kĩ thuật PCR còn có thể phát hiện các mầm bệnh, vi khuẩn và virus gây hại trong thực phẩm, ngay cả khi chúng hiện diện với mức độ rất thấp.  Chính vì vậy, các cơ sở sản xuất và phân phối thực phẩm có thể sàng lọc nguyên liệu đầu vào nhằm bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

Chẩn đoán bệnh di truyền

Phương pháp PCR có thể ứng dụng trong chẩn đoán bệnh di truyền bằng cách nhân bản một trình tự ADN nghi ngờ mang đột biến. Kết quả thu được giúp phát hiện các thay đổi trong gen ngay cả khi các đột biến này xảy ra trong một lượng nhỏ tế bào.

Ứng dụng trong công nghệ sinh học

Dựa vào phản ứng PCR, người ta có thể thu được số lượng lớn trình tự ADN mong muốn. Phương pháp này chỉ khuếch đại trình tự mục tiêu mà không khuếch đại các trình tự khác, do đó ADN mục tiêu thu được ít tạp nhiễm. Các gen thu được có thể được chuyển vào trong sinh vật khác nhằm tạo ra những sinh vật biến đổi gen hoặc thu nhận protein tái tổ hợp.

Ứng dụng trong khoa học pháp y

Phản ứng PCR có vị trí thiết yếu trong xác định danh tính tội phạm. Người ta tiến hành so sánh mẫu ADN thu được với ADN của nghi phạm hoặc cơ sở dữ liệu nhằm tìm ra hung thủ.

Ứng dụng trong xét nghiệm quan hệ cha con, xác định thủ phạm trong các vụ xâm hại tình dục hoặc xác nhận danh tính nạn nhân trong các vụ mất tích.

Kết luận

PCR không chỉ là một kỹ thuật phòng thí nghiệm mà còn là nền tảng cho nhiều tiến bộ trong khoa học và y học hiện đại. Nhờ PCR, con người có thể phát hiện sớm bệnh tật, nghiên cứu hệ gen, hỗ trợ điều tra pháp y và phát triển công nghệ sinh học.